Життєздатні миші, створені з двох геномів сперми за допомогою епігенетики

Завдяки точному редагуванню метилювання ДНК, команда біологів розвитку змогла створити здорових дорослих мишей, використовуючи геноми двох чоловічих сперматозоїдів. Це революційне дослідження, опубліковане в журналі PNAS (DOI: 10.1073/pnas.2425307122), надає беззаперечні докази механізмів геномного імпринтингу та відкриває нові можливості для дослідження репродукції ссавців.

Передумови: Геномний імпринтинг та ефекти походження батьків

У ссавців геномний імпринтинг є епігенетичним явищем, при якому певні гени хімічно маркуються в зародковій лінії, що призводить до моноалельного експресії в залежності від походження з батьків. Імпринтовані локуси зазвичай мають різні патерни метилювання ДНК — додавання метильної групи до основ цитозину — які формуються в спермі або ооцитах та зберігаються під час ембріогенезу. Без метилювання з батьківського та материнського геномів ембріони зазнають серйозних дефектів росту та часто гинуть.

“Імпринтинг забезпечує точно налаштований баланс між ростом ембріона та розподілом ресурсів матері, але також накладає сувору вимогу: один батьківський геном кожної статі,” пояснює професор Вольф Рейк, провідний епігенетик Інституту Бабрахам.

Історичний прогрес до батьківства одностатевих пар у мишей

1. 1991: Виявлення ключових імпринтованих регіонів через картування видалення.
2. 2004: Генерація парфеногенетичних нащадків шляхом видалення семи імпринтованих локусів у ооцитах.
3. 2016–2018: Використання малих цілеспрямованих видалень та злиття гаплоїдних стовбурових клітин для виробництва ембріонів з геномів одностатевих пар, з перинатальною летальністю.
4. На початку 2025: Комбінація 20 геномних видалень дозволила мишам, отриманим з двох сперматозоїдів, досягти дорослого віку.

Актуальне дослідження: Цілеспрямоване перепрограмування метилювання

Замість видалення імпринтованих контрольних регіонів (ICRs) та ризику виникнення непередбачених побічних ефектів, нова робота використовує редагування епігеному на основі CRISPR/dCas9 для додавання або видалення метильних груп на семи критичних ICRs. Дослідники застосували:

• dCas9–DNMT3A фузійні білки для каталізу метилювання в материнських специфічних ICRs.
• dCas9–TET1 фузії для деметилювання батьківських специфічних ICRs.
• Дискримінацію алелів на основі однонуклеотидних поліморфізмів (SNPs) між стандартною лабораторною лінією C57BL/6 та диким тайським штамом.

Введення цих програмованих епігенетичних редакторів у зиготи з двома батьківськими пронуклеусами (після енуклеації геному ооцита та введення двох голів сперматозоїдів) дозволило досягти специфічного реметилювання та деметилювання в межах 500 основ навколо кожного цільового сайту.

Експериментальний процес та технічні специфікації

• Енуклеація пронуклеусів: Повне видалення материнського хроматину за допомогою лазерної абляції.
• Доставка двох сперматозоїдів: Мікроін’єкція двох гаплоїдних голів сперматозоїдів у енуклеований ооцит за допомогою пієзоелектричного пристрою.
• Конструкції для редагування епігеному: Ін-вітро транскрибовані направляючі РНК (gRNAs), що націлюються на ICRs з алельною специфічністю; експресійні плазміди, що кодують dCas9–DNMT3A та dCas9–TET1 під контролем теплового шоку для тимчасового регулювання.
• Валідація метилювання: Секвенування всього геному з використанням бисульфіту та пряма оцінка метилювання Oxford Nanopore на шостий день ембріонального розвитку (E6.5).
• Перенесення ембріонів: Імплантація в псевдосукрових самок CD1.

Результати та ефективність

З 250 перепрограмованих зигот 16 встановили вагітність, в результаті чого народилися три живонароджені малюки. Один з них загинув протягом 24 годин, ймовірно, через неправильну регуляцію IGF2, що призвела до надмірного зростання. Двоє вижили до дорослого віку та продемонстрували нормальну фертильність та епігенетичні профілі за аналізом метилювання та RNA-seq у кількох тканинах.

Загальна ефективність редагування для кожного ICR становила близько 70%, але ймовірність правильно перепрограмувати всі сім локусів в одному ембріоні впала нижче 5%. Редагування поза мішенню — виявлене на <0.1% місць з ≤2 невідповідностями до gRNA — залишається технічною перешкодою.

Додатковий аналіз: Імплікації для біомедичних досліджень

Доктор Джейн Сміт, біолог репродукції з Кембриджського університету, зазначає:

“Цей підхід до епігенетичного інжинірингу може революціонізувати моделювання захворювань — особливо для X-залежних розладів — дозволяючи генерувати одностатеві хіміри та контрольовані фонові імпринти.”

Потенційні застосування включають:

• Моделювання імпринтованих розладів (наприклад, синдроми Прадера-Віллі та Анжелмана) в ізогенних фонах.
• Виробництво генетично ідентичних, але різних за походженням мишачих когорт для досліджень стресу від живлення та розвитку.
• Розробка синтетичних стратегій репродукції для зникаючих ссавців, де співвідношення статей є нерівномірним.

Додатковий аналіз: Етичні та регуляторні аспекти

Створення життєздатних ссавців з одностатевих гамети піднімає етичні питання. Регуляторні органи повинні оновити рекомендації щодо редагування епігеному, щоб врахувати:

1. Передачу генетично змінених станів метилювання через зародкову лінію.
2. Добробут тварин з маніпульованими імпринтингами.
3. Можливості для людських застосувань та пов’язані з цим міжнародні мораторії на редагування геному/епігеному зародкової лінії.

Перспективи та технічні виклики

Основні технічні труднощі включають:

• Покращення ефективності мультиплексного редагування для надійного перепрограмування понад 90% цільових ICRs.
• Розробка високодостовірних епігенетичних редакторів зі зниженою активністю поза мішенню.
• Виявлення додаткових імпринтованих локусів за допомогою профілювання метилому на рівні однієї клітини для забезпечення всебічного контролю походження батьків.

Нові інструменти — такі як прайм-редагування для метилювання та модулятори епігенетики на основі CasX — можуть додатково підвищити точність. Поєднання цих технологій з індукованими системами експресії може дозволити просторово-часовий контроль перепрограмування імпринтингу in vivo.

Висновок

Це дослідження досягло важливого доказу концепції: життєздатні дорослі ссавці з двох батьківських геномів завдяки цілеспрямованому редагуванню метилювання ДНК. Окрім глибоких наслідків для біології розвитку, воно надає надійну платформу для технологій репродукції наступного покоління та моделювання захворювань. Однак для просування до рутинних застосувань знадобляться зусилля, спрямовані на підвищення точності редагування, розуміння ефектів поза мішенню та вирішення етичних викликів.